Imatge Funcional

FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy): Aquesta tècnica permet obtenir imatges basades no en l’espectre d’emissió ni en la intensitat del senyal d’una molècula fluorescent o d’un fluoròfor, sinó en les diferències en el temps de vida mitjana de la fluorescència. El temps de vida fa referència al període durant el qual una molècula fluorescent roman en l’estat excitat abans d’emetre un fotó. FLIM és especialment útil per a conèixer la distribució espacial d’un marcatge i del neu nano-ambient. A més, com que el temps de vida és característic per a cada fluoròfor, permet distingir aquells marcatges que siguin espectralment molt propers, així com també diferenciar-lo d’una autofluorescència present a la mostra.

FLIM-FRET: FRET (Förster Resonance Energy Transfer) és una tècnica per estudiar les interaccions moleculars que precisa d’una molècula donadora i d’una acceptora d’energia. En el cas de FLIM-FRET només es requereix de la mesura del temps de vida del donador que, en el cas de donar-se el fenomen de FRET, el temps de vida del donador s’escurçarà.

Anisotropia de Fluorescència: És un fenomen en què la llum emesa per un fluoròfor mostra diferències d’intensitat segons els diferents eixos de polarització, a causa de la direccionalitat de l’emissió respecte a l’excitació. Aquesta tècnica s'utilitza per mesurar processos que impliquen canvis en la rotació molecular, com ara la unió de lligands, canvis conformacionals de proteïnes o cinètiques de reaccions biomoleculars. Quan una molècula canvia la seva mida o mobilitat, també canvia la seva capacitat de rotar durant el temps d’excitació, fet que es reflecteix en la variació de l’anisotropia.

FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy): És l’anàlisi temporal de la fluctuació de la intensitat de fluorescència en un petit volum (fl). Una de les aplicacions d’aquest anàlisi és el càlcul de les fluctuacions de concentració de partícules fluorescents en solució.

FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching): És una tècnica de fluorescència àmpliament utilitzada per quantificar la mobilitat de molècules dins les cèl·lules. El mètode es basa en l’extinció irreversible (fotoblanqueig) d’un conjunt de molècules en una petita regió de la mostra, mitjançant una il·luminació intensa. A continuació, es monitoritza la recuperació de la intensitat de fluorescència en aquesta regió, la qual es produeix gràcies al desplaçament de molècules fluorescents no fotoblanquejades cap a la zona d’interès.

És el mecanisme que descriu la trasferència d’energia entre dues molècules sensibles a la llum (cromòfors), una donadora i una acceptora, que es troben a distàncies no superiors a 10 nm. Els estudis de FRET són molt útils per detectar proximitat i interaccions entre molècules.

• Leica TCS SP5

La tècnica FLIM permet obtenir imatges basades en les diferències en el temps de vida de la fluorescència, és a dir, el temps que una molècula fluorescent roman excitada abans d’emetre un fotó. És especialment útil per conèixer la distribució espacial dels marcatges i del nanoambient cel·lular. A més, com que cada fluoròfor té un temps de vida característic, permet diferenciar fluoròfors amb espectres molt propers i separar-los de l’auto-fluorescència de la mostra.

• PicoQuant kit integrat al ZEISS LSM 980

Ús de la tècnica de FLIM per estudis de FRET. Donat que la vida mitjana de la fluorescència no es veu afectada per canvis en la intensitat o la concentració del fluoròfor, aquesta és la tècnica més precisa i quantitativa per mesurar la transferència d’energia per ressonància de Förster. En aquest cas, només es requereix de la mesura del temps de vida del donador que es veurà disminuït, en el cas de donar-se el fenòmen de FRET.

• PicoQuant kit integrat al ZEISS LSM 980

La FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy) analitza les fluctuacions temporals de la fluorescència en un volum petit per obtenir informació sobre la concentració, intensitat mitjana i difusió de molècules fluorescents, permetent estudiar, per exemple, esdeveniments d’unió molecular.

La FCCS (Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy) amplia la FCS analitzant la correlació entre diferents colors, de manera que detecta quan molècules marcades amb fluoròfors diferents es mouen conjuntament, oferint una mesura molt sensible de les seves interaccions, independentment de la velocitat de difusió.

• PicoQuant kit integrat al ZEISS LSM 980

L’anisotropia de fluorescència és un fenomen en què la llum emesa per un fluoròfor varia en intensitat segons els diferents eixos de polarització, a causa de la direccionalitat de l’emissió respecte a l’excitació. Aquesta tècnica permet mesurar canvis en la rotació molecular, com la unió de lligands, modificacions conformacionals de proteïnes o cinètiques de reaccions, ja que la mobilitat de la molècula afecta la variació de l’anisotropia durant l’excitació.

• PicoQuant kit integrat al ZEISS LSM 980