Seqüenciació de plasmidis complets (Whole Plasmid Sequencing)

Aquest servei s'ofereix al Mòdul B.

La seqüenciació de plasmidis sencers (Whole Plasmid Sequencing) es realitza mitjançant la tecnologia d’Oxford Nanopore Technologies. Aquesta tecnologia és complementaria a la seqüenciació Sanger ja que permet seqüenciar longituds de fragments més llargs sense la necessitat de dissenyar primers o realitzar reaccions d’amplificació prèvies. El resultat és una seqüència consens del plasmidi.

Utilitzat per a:

• Validar plasmidis amb inserts grans (> 1kb). Sense necessitat de dissenyar diverses parelles de primers. Si es disposa de la seqüència dels oligos que flanquegen l’insert, es poden utilitzar per a l’assemblatge in silico.
• Validar plasmidis desconeguts o que han sofert moltes modificacions i desconeixem la seva estructura.

Avantatges:

• PCR-free i, per tant, no requereix disseny de primers.
• Fins a 24 plasmids diferents per run.
• Les regions riques en GC o regions repetitives poden resoldre’s millor que amb la seqüenciació Sanger. Indiqueu-ho a la sol·licitud d’assaig si aquest és el cas.

Inconvenients:

• Puresa: És molt important que els dsDNA plasmidis siguin de bona qualitat. Els protocols per a les extraccions de plasmidis (minis, midis o maxi-preps) utilitzen buffers amb components com etanol, salts de guanidina, fenol o detergents (SDS, Triton-X100)  que s’arrosseguen a l’elució final. Aquests, afectaran negativament a la preparació de les mostres, la seva seqüenciació i l’assemblatge final. Per tant, és important mesurar en un espectrofotòmetre la puresa del DNA (ratios 260/280 = 1.8 i 260/230 = 2.0) i observar el perfil de la corba d’absorbància. Per a més informació, podeu consultar-ho aquí. 
• Contaminacions: Les contaminacions de DNA genòmic, RNA o d’altres plasmidis durant el procés d’extracció són perjudicials per a la seqüenciació. Es recomanen purificacions que continguin un tractament amb RNAsa. Els plasmidis grans són més susceptibles a fragmentar-se durant l’extracció i manipulació o de formar estructures complexes. En aquests casos, l’assemblatge de les lectures o reads no serà correcte resultant en una seqüència consens errònia.
• Mínim número de mostres: demanem un mínim de 4 plasmidis.

Com s’han d’entregar les mostres?

Cal enviar la següent informació per correu electrònic (sgieb@uab.cat) o emplenant la sol·licitud d’assaig. Si els plasmidis no passen aquest QC, la preparació de la llibreria no serà eficient afectant a la seqüenciació i a l’anàlisi posterior.

Informació necessària:

1. Nom de la mostra.
2. Tipus de vector (pGEX, pAAV-GFP, pUC19, pBluescript, pBR322, pGEMT, etc).
3. Mida (bp) aproximada del plasmidi.
4. Puresa (ratios 230/280 i 230/260).  
5. Tampó o buffer d’elució: 10 mM Tris, pH 8.0-8.5 o nuclease-free water.
6. Concentració ng/ul. Indicar si s’ha mesurat amb Nanodrop o amb un mètode fluorimètric (Ex. Qubit). Portar entre 100-500 ng/ul (si ha estat mesurada en un espectrofotòmetre) o de 100 ng/ul (si ha estat mesurada per fluorimetria).

Concentració i volum

Concentració al Nanodrop	Concentració al Qubit (fluorimètric)	Volum mínim
500-1000 ng/µl	100-500 ng/µl	10 µl

 

Opcional: si teniu la seqüència de dos primers (forward i reverse) que flanquegen l'insert, ens les podeu fer arribar ja que es poden incloure a l'anàlisi.

En cas que el plasmidi tingui algunes característiques especials a tenir en compte, si us plau indiqueu-ho a la sol·licitud d'assaig o envieu-nos un correu electrònic (sgieb@uab.cat).

Quants plasmidis es poden seqüenciar?

Acceptem com a mínim 4 o 5 plasmidis per a fer la seqüenciació. En cas que se n’enviïn menys, esperarem a tenir peticions d’altres usuaris.

En cas d’entregar-se un número elevat de plasmidis (màxim 24), s’aplicarà un descompte. Consulteu amb l’SGiEB.

Quan s’entreguen els resultats?

En general, en un parell de dies es poden obtenir els resultats. 

Com s’entreguen els resultats?

S’envien per correu electrònic, segons s’hagi indicat a la sol·licitud d’assaig i en un arxiu comprimit.

Tipus d’arxius que s’entreguen per a cada plasmidi:

• annotations.bed = llista de les anotacions o features (es pot obrir amb un editor de text).
• annotations.gbk = mapa del plasmidi amb anotacions en format GeneBank (es pot obrir amb Snapegene o programes similars).
• assembly.stats = no diu gaire cosa, la mida del plasmidi i la qualitat
• final.fasta = seqüència consens (es pot obrir amb Snapgene --> Features --> Detect common features).
• final.fastq = qualitat de cadascuna de les bases (es pot obrir amb Snapgene o programes similars).
• .html = report del plasmidi.
• .fastq.gz = dades crues (opcional).

L’anàlisi o assemblatge es fa amb l’aplicació open-source EPI2ME d’Oxford Nanopore Technologies. En cas de que es vulguin les dades crues de la seqüenciació (format “.fastq” o “.fast.gz”) cal que ens ho indiqueu a la sol·licitud d’assaig.