Real Time PCR

La PCR en temps real permet una quantificació absoluta o relativa dels nivells d'RNA missatger (mRNA) d’una determinada mostra d'RNA. El material de partida tant pot ser RNA total, com missatger. En ambdós casos, l’RNA es retrotranscriu a cDNA.
La metodologia consisteix en dissenyar uns primers específics que amplifiquin mitjançant PCR el fragment del qual es desitja conèixer el nivell d’expressió. L’expressió del fragment es detecta per fluorescència amb intercalant (com el SYBRGREEN) o amb sondes específiques (com les sondes Taqman). A cada cicle de PCR es mesura la fluorescència emesa i s’obté una corba quan es completen tots els cicles (normalment uns 40). Aquesta corba té un valor característic que és el Ct (cycle threshold), del qual valors baixos corresponen a expressió elevada.
Normalment es detecta el nivell d’expressió d’un sol fragment. Tot i així, es pot detectar simultàniament varis fragments per cada mostra, quan es disposa d’un fluorocrom específic per cada fragment.
La quantificació absoluta requereix l’elaboració d’una recta patró amb diferents concentracions del fragment que es vol amplificar.
A part dels assajos d’expressió gènica, també es poden dur a terme detecció de SNPs i anàlisi de metilació del DNA.

Equip: C1000 Touch Thermal Cycler (BIORAD)

Capçal: Real Time System CFX96


	Activitat
Assaig d'expressió	Hi ha dos assajos possibles: una etapa o dues etapes. El primer consisteix en realitzar la retrotranscripció i la PCR sense interrupció. Si es realitza l’assaig en dues etapes, aquestes es duen a terme separadament. En aquest cas, l’usuari pot optar per a realitzar la retrotranscripció al seu laboratori.
Detecció de mutacions	Existeixen assajos específics per a detectar mutacions puntuals (SNPs) i metil·lació del DNA. Aquesta detecció es basa en la diferent temperatura de fusió dels productes que es van generant en una PCR. El nom en anglès d’aquesta tècnica és High Resolution Melting (HRM).
PCR	Cada usuari pot dissenyar el programa de PCR que s’ajusti a les seves necessitats.