Seqüenciació DNA Sanger
Aquest servei s'ofereix al Mòdul B.
- La seqüenciació automàtica de DNA desenvolupada per Applied Biosystems utilitza la metodologia de Sanger amb una polimerasa termostable que permet una reacció de seqüenciació cíclica.
- El producte de la reacció es separa per electroforesi capil·lar. El marcatge dels fragments es realitza amb 4 fluorocroms (un per cada base). Aquests fluorocroms poden estar incorporats en el primer, "dye primer kit", o bé en els ddNTPs o terminadors, "dye terminator kit".
- El DNA a seqüenciar ha de ser de la màxima qualitat possible, i es pot partir de: productes de PCR, plasmidis o fags. Els primers que s’han d’emprar per a la seqüenciació cíclica poden ser els específics de cada producte de PCR o bé els universals dels plasmidis o fags (veure llista de primers disponibles més avall).
Equip: Seqüenciador ABI3500 Genetic Analyzer
Kits: Big Dye Terminator 1.1 i Big Dye Terminator 3.1
COM ENVIAR-NOS LES MOSTRES PER SEQÜENCIAR?
- Per seqüenciar més de 16 mostres, cal dur-les en placa (96 pouets) per a poder-les processar i enviar un arxiu Excel amb el nom de les mostres i les seves coordendades en la placa.
- Els prodcutes de PCR han de ser específics (banda única en un gel d'agarosa).
- Sempre que sigui possible, envieu-nos la fotografia del gel d'agarosa.
Servei | Mostres a enviar |
---|---|
Electroforesi de les mostres pre-seqüenciades pels usuaris. | Enviar-nos el producte de la reacció de seqüenciació DNA purificat en tubs de 1,5 ml o 0,2 ml. Si el producte no està purificat, indiqueu-ho a la sol·licitud d'assaig i a l'SGiEB farem la purificació. |
Reacció de seqüenciació i posterior electroforesi |
Productes de PCR purificats: es nessiten 20 ng totals. Plasmidis: es necessiten 100 ng totals. Primers: 5 µl concentrats a 5 µM. |
Purificació de producte de PCR banda única |
Portar 5 µl del producte de PCR (sense purificar). Cal que sigui específic (banda única en un gel d'agarosa). |
Purificació de banda d’agarosa | Tub de 1.5 ml amb la banda d’agarosa (recentment retallada o guardada en fred). |
L'SGiEB disposa dels primers següents:
M13univ: 5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3'
M13rev: 5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3'
SP6: 5'-GAT TTA GGT GAC ACT ATA G-3'
T7: 5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3'
T7term: 5'-GC T AGT TAT TGC TCA GCG G-3'
T3: 5'-AAT TAA CCC TCA CTA AAG GG-3'