Seqüenciació DNA Sanger

Aquest servei s'ofereix al Mòdul B.

• La seqüenciació automàtica de DNA desenvolupada per Applied Biosystems utilitza la metodologia de Sanger amb una polimerasa termostable que permet una reacció de seqüenciació cíclica. 
• El producte de la reacció es separa per electroforesi capil·lar. El marcatge dels fragments es realitza amb 4 fluorocroms (un per cada base). Aquests fluorocroms poden estar incorporats en el primer, "dye primer kit", o bé en els ddNTPs o terminadors, "dye terminator kit". 
• El DNA a seqüenciar ha de ser de la màxima qualitat possible, i es pot partir de: productes de PCR, plasmidis o fags. Els primers que s’han d’emprar per a la seqüenciació cíclica poden ser els específics de cada producte de PCR o bé els universals dels plasmidis o fags (veure llista de primers disponibles més avall). 

 

Equip: Seqüenciador ABI3500 Genetic Analyzer 

Kits: Big Dye Terminator 1.1 i Big Dye Terminator 3.1

Com enviar les mostres per seqüenciació Sanger?

1. Omplir degudament la Sol·licitud d'assaig.
2. Els prodcutes de PCR han de ser específics (banda única en un gel d'agarosa). Sempre que sigui possible, envieu-nos la fotografia del gel d'agarosa.
3. Per seqüenciar més de 16 mostres:

• Porteu-les en una placa de 96 pouets (0,2 ml) i segellada. No s'acceptaran altres tipus plaques (cultius o ELISA).
• Envieu-nos l'arxiu Excel "Formulari entrega Sanger placa96" (veure enllaç dreta) degudament emplenat amb el nom de les mostres i les seves coordenades en la placa a sgieb@uab.cat.

Servei	Mostres a enviar
Electroforesi de les mostres pre-seqüenciades pels usuaris.	Enviar-nos el producte de la reacció de seqüenciació DNA purificat en tubs de 1,5 ml o 0,2 ml. Si el producte no està purificat, indiqueu-ho a la sol·licitud d'assaig i a l'SGiEB farem la purificació.
Reacció de seqüenciació i posterior electroforesi	Productes de PCR purificats: es nessiten 20 ng totals. Plasmidis: es necessiten 100 ng totals.  Primers: 5 µl concentrats a 5 µM.
Purificació de producte de PCR banda única	Portar 5 µl del producte de PCR (sense purificar). Cal que sigui específic (banda única en un gel d'agarosa).
Purificació de banda d’agarosa	Tub de 1.5 ml amb la banda d’agarosa (recentment retallada o guardada en fred).

 

L'SGiEB disposa dels primers següents: 

M13univ: 5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3' 

M13rev: 5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3' 

SP6: 5'-GAT TTA GGT GAC ACT ATA G-3' 

T7: 5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3' 

T7term: 5'-GC T AGT TAT TGC TCA GCG G-3' 

T3: 5'-AAT TAA CCC TCA CTA AAG GG-3'