Àcids Nucleics: Extracció, Quantificació i Anàlisi de Qualitat
Aquests serveis estan repartits entre el Mòdul A i el Mòdul B:
Extracció d'àcids nuclèics (DNA i RNA) automatitzada: Mòdul A
El Maxwell® RSC de Promega és un sistema automatitzat dissenyat per a l’extracció eficient i reproductible d’àcids nucleics a partir de mostres d’origen divers, tant animals com vegetals, cultius cel·lulars o teixits. El mètode de purificació llisa la mostra i utilitza partícules paramagnètiques que interaccionen amb els àcids nucleics, garantint una purificació d’alta qualitat i amb mínims contaminants. El procés és totalment automatitzat i finalitza amb l’elució del material genètic purificat en un tub, llest per a ser utilitzat en tècniques moleculars posteriors. L’equip pot processar d’1 a 16 mostres simultàniament i el protocol té una durada aproximada de 30–50 minuts, depenent del tipus de kit i mostra utilitzats.
El funcionament es gestiona des d’una tauleta amb software específic, que facilita la selecció del protocol i el monitoratge del procés, assegurant un ús senzill i resultats consistents.
Existeixen kits per a l'extracció de:
- DNA genòmic (sang, teixits, cultius, hisops bucals, FFPE, aigües…)
- RNA total (incloent FFPE RNA)
- miRNA (amb kits específics miRNA-enriched)
- cfDNA/ccfDNA (circulating cell-free DNA)
- DNA i RNA d'aigües residuals
Per a usuaris no autoritzats al Mòdul A, contacteu prèviament amb l'SGiEB (sgieb@uab.cat). Per als usuaris ja autoritzats, recordeu fer la reserva.
Quantificació i puresa: Nanodrop i Qubit
NanoDrop ND-1000/2000: Mòdul A i B
El NanoDrop® ND-1000 o el NanoDrop® ND-2000 és un espectrofotòmetre d’espectre total (220-750nm) que mesura concentracions amb 2µl de mostra, amb gran exactitud i reproductibilitat. Utilitza la tensió superficial de la gota per mantenir la mostra en el seu lloc. A més a més, té la capacitat de mesurar mostres molt concentrades, sense necessitat de diluir-les (accepta 50X més de concentració que les mesures estàndards amb cubetes). Aquestes característiques el fan idoni pel mesurament de la abserovància d’àcids nucleics (DNA i RNA) i/o proteïnes per a determinar la seva qualitat i la seva concentració.
El software calcula automàticament la concentració dels àcids nucleics seguint la relació:
- 1 A260nm = 1 OD DNA = 50 µg/ml
- 1 A260nm = 1 OD RNA = 40 µg/ml
La concentració de proteïna es pot calcular per mostres a les quals els hi hem aplicat el mètode de Bradford, Pierce, Lowry, BCA o la mesura directa d'absorbància a 280 nm.
Tanmateix, es pot ajustar el coeficient d'extinció molar per a qualsevol proteïna. A més, l'aparell permet la conversió automàtica d'absorbància en concentració per mostres de BSA, Lisozim i IgG.
Equip:
- NanoDrop ND-1000 (Mòdul B)
- NanoDrop ND-2000 (Mòdul A)
Per a usuaris no autoritzats al Mòdul A, contacteu prèviament amb l'SGiEB (sgieb@uab.cat). Per als usuaris ja autoritzats, recordeu fer la reserva. L’accés al Mòdul B queda restringit als horaris d’obertura.
Qubit 2.0 Fluorometer: Mòdul B
A diferència del NanoDrop, el Qubit és un fluoròmetre. Aquest instrument mesura l’emissió fluorescent de les mostres després d’haver-hi afegit fluorocroms específics que s’uneixen selectivament a l’àcid nucleic d’interès. Aquesta interacció permet determinar amb molta precisió la concentració real de la mostra. A més, el Qubit pot distingir entre DNA de cadena simple (ssDNA) i DNA de doble cadena (dsDNA), fet que proporciona una quantificació molt més acurada que la que ofereix el NanoDrop.
Un altre avantatge important és que el Qubit no es veu afectat per la presència de contaminants com proteïnes, fenol, guanidina o altres components habituals en extraccions, mentre que el NanoDrop els detecta com a absorbància i pot sobreestimar notablement la concentració. Per això, el Qubit és especialment recomanable quan es requereix precisió, com ara en aplicacions de qPCR, NGS o clonatge.
Cal tenir en compte que les mesures al Qubit necessiten una preparació prèvia de mostra i l’elaboració d’una recta patró amb estàndards.
Cal considerar en els assajos de DNA de doble cadena que la concentració mesurada al Nanodrop pot arribar a ser fins a 10 vegades superior que la mesurada al Qubit, especialment si hi ha contaminants o RNA residual. Per tant, s'ha de tenir en compte aquest efecte a l'hora de mesurar la concentració d'una mostra.
Equip:
- Qubit 2.0 Fluorometer
Serveis:
- Reacció i quantificació: l'usuari envia la mostra de DNA o RNA i a l'SGiEB la processem. Es requereix un mínim de 2 µl en tubs de 0.2 ml ben rotulats i enumerats i que corresponguin amb el nom de la sol·licitud d'assaig entregada. Oferim els següents kits (veure l'apartat "Kits").
- Quantificació: només en règim d'autoservei. En aquest cas, l'usuari disposa del kit al seu laboratori i només requereix l'ús del fluoròmetre.
Kits:
- dsDNA HS Assay: 0.2–100 ng
- dsDNA BR Assay: 2–1000 ng
- ssDNA Assay: 1–200 ng
- RNA Assay: 5–100 ng
Recordeu completar la Sol·licitud d'assaig per al Mòdul B. L’accés al Mòdul B queda restringit als horaris d’obertura.
Anàlisi de Qualitat i Integritat
Bioanalyzer o Labxip (Mòdul B)
El Bioanalyzer utilitza electroforesi capil·lar en microxip per separar els àcids nucleics i determinar-ne tant la integritat (qualitat) com la quantitat. És un mètode altament sensible que només requereix 1 µl de mostra, fet que el converteix en una opció ideal quan es disposa de molt poc material, la mostra és valuosa o té una concentració baixa.
La detecció es basa en la fluorescència dels colorants específics d’Agilent, que s’intercalen entre les molècules d’àcid nucleic i permeten obtenir perfils precisos de DNA o RNA.
Equip:
- Agilent 2100 Bioanalyzer
Servei:
L'usuari envia la mostra de DNA o RNA congelada o en gel i a l'SGiEB la processem. Es requereix un mínim de 3 µl en tubs de 0.2 ml ben rotulats i enumerats i que corresponguin amb el nom de la Sol·licitud d'assaig entregada.
Kits:
- DNA HS (11 mostres)
- DNA 1000 i 7500 (12 mostres)
- RNA 6000 Nano/Pico (12 mostres)
TapeStation (Mòdul B)
Al igual que el Bioanalyzer 2100 (Agilent), la TapeStation consisteix en un sistema de microelectroforesi automatitzada dissenyada per poder determinar la longitud (parells de bases o base pairs) i realitzar controls de qualitat del DNA i l’RNA.
A diferència del Bioanalyzer, la TapeStation permet l'anàlisi d'una sola mostra (+ marcador de pes molecular o ladder) fins a un màxim de 15.
Per a més informació d'aquest equip i les diferències amb el Bioanalyzer, consulteu la notícia.
Equip:
- Agilent TapeStation 4150
Servei:
L'usuari envia la mostra de DNA o RNA i a l'SGiEB la processem. Es requereix un mínim de 3 µl en tubs de 0.2 ml ben rotulats i enumerats i que corresponguin amb el nom de la Sol·licitud d'assaig entregada.
Kits:
- D1000
- D1000 High Sensitivity
- D5000 High Sensitivity
- Genomic DNA
| Equipament | Volum utilitzat | Volum a entregar | Rang detecció * |
|---|---|---|---|
| Bioanalyzer | |||
| DNA 1000 | 1 µl | 3 µl | 0,5 - 50 ng/µl |
| DNA High Sensitivity | 1 µl | 3 µl | 5 - 500 pg/µl |
| RNA Nano | 1 µl | 3 µl | 25 - 500 ng/µl RNA total ó 25 - 250 ng/µl mRNA |
| TapeStation 4150 | |||
| D1000 | 1 µl | 3 µl | 0,1 - 50 ng/µl |
| D1000 High Sensitivity | 2 µl | 5 µl | 10-1000 pg/µl |
| D5000 High Sensitivity | 2 µl | 5 µl | 10 - 1000 pg/µl |
| Genomic DNA | 1 µl | 3 µl | 10 - 100 ng/µl |
(*) Si quantifiqueu els àcids nuclèics amb Nanodrop, cal que aquestes concentracions siguin més elevades. Indiqueu a la Sol·licitud d'assaig el mètode de quantificació utilitzat (Nanodrop, Qubit, etc).
En cas que estigueu interessats en fer un assaig que requereixi algún altre kit, contacteu amb nosaltres.
Recordeu completar la Sol·licitud d'assaig per al Mòdul B. L’accés al Mòdul B queda restringit als horaris d’obertura.