Microscòpia Òptica (OM)

Permet l’observació de mostres voluminoses mitjançant llum transmesa, reflectida, polaritzada o bé per fluorescència. El personal tècnic col·locarà els accessoris necessaris en cada cas.

Microscopis equipats amb llum transmesa, DIC i fluorescència, que permeten analitzar les mostres amb rapidesa i agilitat.

Lisosomes transfectats amb tecnologia BacMam, expressant GFP.

Aquesta tècnica d’imatge permet realitzar un ampli ventall d’estudis amb alt contrast i nitidesa gràcies al pinhole, que permet captar només la llum que prové del pla enfocat. Principalment:

• Captacions en 3D : es realitzen seccions òptiques a la mostra per tal d’obtenir la informació en volum ja sigui amb un objectiu qualitatiu o quantitatiu.

A) Rizoma de "Convallaria majalis". B) Detall d'una secció de ronyó de ratolí. Crèdit: Servei de Microscòpia, UAB

• Caracteritzacions d’espectres d’emissió: Anàlisi que permet descobrir l’emissió característica de la mostra, o d’algun element d’aquesta.

Caracterització de l'espectre d'emissió d'unes partícules de plàstic. Cortesia: Aliro Villacorta (Alba Hernández-Bonilla, Departament de Genètica i Microbiologia, UAB).

Experiment per avaluar els pics de calci que generen les cèl·lules degut a una estímul determinat. Cortesia: Nour Al Bast (Carme Nogués, Departament de Biologia Cel·lular, UAB). 

Són aquells que permeten l’estudi de dinàmiques cel·lulars, d’orgànuls o de canvis iònics, també coneguts com a in vivo imaging. És important que l’usuari conegui l’escala temporal en què es dona l’esdeveniment per tal de poder ajustar l’equip.

Adquisició d’imatges de fluorescència amb alta resolució gràcies al mòdul d’Airyscan 2, que permet arribar a una resolució lateral de 120 nm i axial de 350nm (mostra depenent).

Mapeig de la mostra de manera automatitzada, tant amb confocal com amb camp ample, obtenint aquesta manera la informació de la totalitat de la mostra.

FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy): Aquesta tècnica permet obtenir imatges basades no en l’espectre d’emissió ni en la intensitat del senyal d’una molècula fluorescent o d’un fluoròfor, sinó en les diferències en el temps de vida mitjana de la fluorescència. El temps de vida fa referència al període durant el qual una molècula fluorescent roman en l’estat excitat abans d’emetre un fotó. FLIM és especialment útil per a conèixer la distribució espacial d’un marcatge i del neu nano-ambient. A més, com que el temps de vida és característic per a cada fluoròfor, permet distingir aquells marcatges que siguin espectralment molt propers, així com també diferenciar-lo d’una autofluorescència present a la mostra.

FLIM-FRET: FRET (Förster Resonance Energy Transfer) és una tècnica per estudiar les interaccions moleculars que precisa d’una molècula donadora i d’una acceptora d’energia. En el cas de FLIM-FRET només es requereix de la mesura del temps de vida del donador que, en el cas de donar-se el fenomen de FRET, el temps de vida del donador s’escurçarà.

Anisotropia de Fluorescència: És un fenomen en què la llum emesa per un fluoròfor mostra diferències d’intensitat segons els diferents eixos de polarització, a causa de la direccionalitat de l’emissió respecte a l’excitació. Aquesta tècnica s'utilitza per mesurar processos que impliquen canvis en la rotació molecular, com ara la unió de lligands, canvis conformacionals de proteïnes o cinètiques de reaccions biomoleculars. Quan una molècula canvia la seva mida o mobilitat, també canvia la seva capacitat de rotar durant el temps d’excitació, fet que es reflecteix en la variació de l’anisotropia.

FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy): És l’anàlisi temporal de la fluctuació de la intensitat de fluorescència en un petit volum (fl). Una de les aplicacions d’aquest anàlisi és el càlcul de les fluctuacions de concentració de partícules fluorescents en solució.

FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching): És una tècnica de fluorescència àmpliament utilitzada per quantificar la mobilitat de molècules dins les cèl·lules. El mètode es basa en l’extinció irreversible (fotoblanqueig) d’un conjunt de molècules en una petita regió de la mostra, mitjançant una il·luminació intensa. A continuació, es monitoritza la recuperació de la intensitat de fluorescència en aquesta regió, la qual es produeix gràcies al desplaçament de molècules fluorescents no fotoblanquejades cap a la zona d’interès.

Cèl·lules HeLa marcades amb ConcanavalinaA-488, podent-se observar la membrana i el tràfic vesicular. Crèdit: SMiDRX, UAB

La TIRFM permet obtenir imatges amb una elevada resolució axial, de l’ordre de 100 nm, i, gràcies al seu rang de treball, facilita l’estudi de processos associats a la membrana.

El processament d’imatges té com a objectiu millorar la qualitat de la imatge adquirida, ja sigui per a una presentació més òptima o per facilitar-ne l’anàlisi quantitativa posterior.

L’anàlisi i la quantificació d’imatges permeten extreure dades útils, sempre que aquestes hagin estat adquirides específicament amb aquesta finalitat.

El tipus de preparació de mostres que realitza el personal tècnic comprèn des de la realització de marcatges directes (com ara traçadors cel·lulars, marcatges genèrics d'ADN, de proteïnes, etc) fins a immunodetecció d’antígens per a immunofluorescència.