Microscopia Óptica (OM)

Permite la observación de muestras voluminosas mediante luz transmitida, reflejada, polarizada o bien por fluorescencia. El personal técnico colocará los accesorios necesarios en cada caso.

Microscopios equipados con luz transmitida, DIC y fluorescencia, que permiten analizar las muestras con rapidez y agilidad.

Lisosomas transfectados con tecnología BacMam, expresando GFP. Crédito: SMiDRX, UAB.

Esta técnica de imagen permite realizar una amplia variedad de estudios con alto contraste y nitidez gracias al pinhole, que permite captar únicamente la luz que proviene del plano enfocado. Principalmente:

• Captaciones en 3D: se realizan secciones ópticas de la muestra con el fin de obtener información en volumen, ya sea con un objetivo cualitativo o cuantitativo.

A) Rizoma de "Convallaria majalis". B) Detalle de una sección de riñón de ratón. Crèdit: SMiDRX, UAB.

• Caracterización de espectros de emisión: análisis que permite identificar la emisión característica de la muestra o de alguno de sus componentes.

Caracterización del espectro de emisión de unas partículas de plástico. Crédito: Aliro Villacorta (Alba Hernández-Bonilla, Departament de Genètica i Microbiologia, UAB).

Experimento para evaluar los picos de calcio que generan las células después de un estímnulo determinado. Cortesía: Nour Al Bast (Carme Nogués, Dept. de Biologia Celul·lar, UAB).

Son aquellos que permiten el estudio de dinámicas celulares, de orgánulos o de cambios iónicos, también conocidos como in vivo imaging. Es importante que el usuario conozca la escala temporal en la que se produce el evento para poder ajustar el equipo.

Adquisición de imágenes de fluorescencia con súper resolución gracias al módulo de Airyscan 2, que permite alcanzar una resolución lateral de 120 nm y axial de 350 nm (dependiendo de la muestra).

Mapeo de la muestra de manera automatizada, tanto con confocal como con campo amplio, obteniendo de este modo la información de la totalidad de la muestra.

FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy): Esta técnica permite obtener imágenes basadas no en el espectro de emisión ni en la intensidad de la señal de una molécula fluorescente o fluoróforo, sino en las diferencias en el tiempo de vida media de la fluorescencia. El tiempo de vida se refiere al período durante el cual una molécula fluorescente permanece en el estado excitado antes de emitir un fotón. FLIM es especialmente útil para conocer la distribución espacial de un marcador y del nanoambiente que lo rodea. Además, dado que el tiempo de vida es característico para cada fluoróforo, permite distinguir marcajes que son espectralmente muy cercanos, así como diferenciarlo de una autofluorescencia presente en la muestra.

FLIM-FRET: FRET (Förster Resonance Energy Transfer) es una técnica para estudiar las interacciones moleculares que requiere una molécula donadora y una aceptora de energía. En el caso de FLIM-FRET, solo se necesita medir el tiempo de vida del donador, que en presencia del fenómeno FRET se acortará.

Anisotropía de Fluorescencia: Es un fenómeno en el que la luz emitida por un fluoróforo muestra diferencias de intensidad según los diferentes ejes de polarización, debido a la direccionalidad de la emisión respecto a la excitación. Esta técnica se utiliza para medir procesos que implican cambios en la rotación molecular, como la unión de ligandos, cambios conformacionales de proteínas o cinéticas de reacciones biomoleculares. Cuando una molécula cambia su tamaño o movilidad, también cambia su capacidad para rotar durante el tiempo de excitación, lo que se refleja en la variación de la anisotropía.

FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy): Es el análisis temporal de la fluctuación de la intensidad de fluorescencia en un pequeño volumen (fl). Una de las aplicaciones de este análisis es el cálculo de las fluctuaciones de concentración de partículas fluorescentes en solución.

FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching): Es una técnica de fluorescencia ampliamente utilizada para cuantificar la movilidad de moléculas dentro de las células. El método se basa en la extinción irreversible (fotoblanqueo) de un conjunto de moléculas en una pequeña región de la muestra, mediante una iluminación intensa. A continuación, se monitoriza la recuperación de la intensidad de fluorescencia en esa región, que se produce gracias al desplazamiento de moléculas fluorescentes no fotoblanqueadas hacia la zona de interés.

Células HeLa marcadas con ConcanavalinaA-488, pudiéndose observar la membrana y el tráfico vesicuar. Crèdit: SMiDRX, UAB.

La TIRFM permite obtener imágenes con una elevada resolución axial, del orden de 100 nm, y, gracias a su rango de trabajo, facilita el estudio de procesos asociados a la membrana.

El procesamiento de imágenes tiene como objetivo mejorar la calidad de la imagen adquirida, ya sea para una presentación más óptima o para facilitar su análisis cuantitativo posterior.El análisis y la cuantificación de imágenes permiten extraer datos útiles, siempre que estas hayan sido adquiridas específicamente con esta finalidad.

El tipo de preparación de muestras que realiza el personal tècnic abarca desde la realización de marcajes directos (como trazadores celulares, marcajes genéricos de ADN, de proteínas, etc.) hasta la inmunodetección de antígenos mediante inmunofluorescencia.