La defensa de la Tesi de Josu López-Fernández amb el títol Heterologous Rhizopus oryzae lipase expressed in Komagataella phaffii: improved production, biochemical characterization and industrial applications, tindrà lloc a les 11:00h del dia 22 d'Abril i a l'Institut de Ciències i Tecnologia Ambiental, a la sala Z/023 i Z/022.

Aquesta tesi doctoral ha estat desenvolupada en el marc del programa de doctorat de Biotecnologia de la UAB i sota la co-direcció del Dr. Francisco Valero i la Dra. Dolors Benaiges del Departament d'Enginyeria Química Biològica i Ambiental.

Els membres del tribunal són: 

• Presidenta: Suzana Ferreira Dias Universidade de Lisboa Instituto Superior de Agronomia. LEAF (Linking Landscape, Environment, Agriculture and Food)
• Secretaria: Marina Guillén Montalbán. Departament d’Enginyeria Química, Biològica i Ambiental. Universitat Autònoma de Barcelona.
• Vocal: Alicia Prieto Orzanco. Grupo de Sistemas Microbianos e Ingeniería de Proteínas Centro de Investigaciones Biológicas Margarita Salas (CSIC)

Resum:

En la presente tesis, se ha estudiado la lipasa 1,3-regioespecífica de Rhizopus oryzae (ROL), mejorando su estabilidad operacional y su producción heteróloga, y se ha probado su capacidad biocatalítica en diferentes reacciones de interés industrial.

En lo relativo a la estabilidad operacional, se evaluó el efecto del soporte de inmovilización y sus grupos funcionales en la actividad de la secuencia madura de ROL (rROL) durante la síntesis de biodiesel en un medio de reacción sin solvente (solvent-free) con aceite de orujo como sustrato modelo. Los soportes de polimetacrilato con cadenas hidrocarbonadas mejoraron la estabilidad operacional del biocatalizador permitiendo una mayor vida media. Se estudió también la producción de biodiesel de segunda y tercera generación a partir de aceites vegetales no comestibles, de aceites microbianos y de aceites de fritura usados (WCO), respectivamente. Además, la síntesis debiodiesel a partir de WCO se monitoreó en línea mediante el uso de espectroscopia de infrarrojo cercano (NIR) en un reactor de escala de laboratorio (50 mL), obteniendo una alternativa exitosa a la cromatografía de gases —la técnica más comúnmente empleada. La estabilidad del biocatalizador también se mejoró mediante la adición de los 28 aminoácidos del extremo C-terminal de la prosecuencia nativa del enzima —que han sido descritos que actúan como chaperona intramolecular— al extremo N‑terminal de rROL obteniendo proROL. La estabilidad de proROL mejoró sustancialmente tanto libre como inmovilizada en comparación con rROL frente a distintas condiciones de pH, temperatura y solventes orgánicos. Además, se obtuvo 1.25 y 3 veces más estabilidad operacional durante la síntesis solvent-free de biodiesel y la esterificación de butirato de etilo (aroma natural de la piña), respectivamente.

La producción heteróloga del enzima se realizó en la levadura metilotrófica Komagataella phaffii (Pichia pastoris) bajo el promotor inducible por metanol de la alcohol oxidasa 1 (P_AOX1). La producción de proROL, en lugar de rROL, permitió conseguir un bioproceso con una producción y una productividad volumétrica 5.4 y 4.4 veces superiores, respectivamente, en el caso más extremo. Asimismo, proROL demostró reducir los efectos nocivos de su producción en K. phaffii consiguiendo, a diferencia de con rROL, la expresión de dicha lipasa bajo el promotor constitutivo e independiente de metanol de la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (P_GAP). Se confirmó así la importancia de los 28 aminoácidos de la prosecuencia en su papel como chaperona intramolecular al mejorar la estabilidad del biocatalizador y su producción heteróloga. También se demostró que estos aminoácidos alteraban la especificidad de sustrato pero no tenían un efecto marcado en la caracterización bioquímica de proROL frente rROL.

Este biocatalizador con características mejoradas se probó con éxito en la esterificación de acetato/butirato de isoamilo, con independencia del empleo de un alcohol ramificado y sus potenciales impedimentos estéricos. La producción de butirato de isoamilo —que superó los resultados obtenidos con el acetato de isoamilo— se optimizó y se cambió de escala a un reactor de 150 mL. También se empleó aceite de fusel como sustrato de bajo coste alternativo al alcohol isoamílico y se estudió la especificidad de proROL por los isómeros estructurales 2- y 3-metilbutanol.

Finalmente, proROL también se empleó y se comparó con la lipasa 1 de Candida rugosa (CRL1) en la producción de ácido poliláctico (PLA) a partir de ácido láctico (condensación directa) y a partir de lactida (polimerización por apertura de anillo, ROP). proROL superó a CRL1 en ambas reacciones, aunque con independencia de la enzima, únicamente se obtuvo PLA detectable a través de resonancia magnética nuclear (NMR) mediante ROP.

En resumen, el detallado estudio realizado en esta tesis, integrando diversas áreas de conocimiento, ha llevado a una mejora de la enzima en estudio (proROL) facilitando su potencial como biocatalizador en la industria.